*法凱氏定氮法
1 鎢酸沉淀法
本法系通過測定供試品的總氮含量以及經鎢酸沉淀去除蛋白的供試品濾液中的非蛋白氮含量，計算出蛋白質的含量。
供試品溶液的制備 （1）總氮測定溶液的制備精密量取供試品1ml，用*準確稀釋至每1ml含氮量約1mg。
（2）非蛋白氮測定溶液的制備精密量取供試品2ml，加水14ml、10%鎢酸鈉溶液2ml、硫酸溶液（1.86→100）2ml,搖勻，靜置30分鐘過濾，取濾液測定。
測定法 精密量取總氮測定溶液1ml，置凱氏定氮瓶中，照氮測定法（附錄Ⅵ A）測定供試品中總氮含量。同時做空白對照。
精密量取非蛋白氮測定溶液5ml，置凱氏定氮瓶中，照氮測定法（附錄Ⅵ A）測定供試品中非蛋白氮含量。
按下式計算
CTN（mg/ml）=（VX1-V0）×c×14.01×n×2
_________________________
V1
CNPN（mg/ml）=（VX2-V0）×c×14.01×n×2
_________________________
V2
CPN（mg/ml）=CTN-CNPN
供試品蛋白質含量（%,g/ml）=CPN×6.25×100
_______________
1000
式中CTN為供試品溶液總氮含量，mg/ml;
CNPN為供試品溶液非蛋白氮含量，mg/ml;
VX1為供試品總氮測定溶液消耗酸滴定液的體積,ml;
VX2為供試品非蛋白氮測定溶液消耗酸滴定液的體積，ml;
V0為空白試驗消耗酸滴定液的體積，ml;
c為硫酸滴定液的濃度，mol/L；
CPN為供試品蛋白氮含量，mg/ml;
n為供試品的稀釋倍數；
V1為供試品總氮測定溶液的體積，ml；
V2為供試品非氮測定溶液的體積，ml；
14.01為氮的相對原子質量；
6.25 為常數（1g氮相當于6.25g蛋白質）。
【附注】（1）供試品蛋白質含量如超過10%（g/ml），除蛋白質時應適當加大供試品稀釋倍數，10%鎢酸鈉溶液及硫酸溶液用量相應地按比例增加，使溶液中的鎢酸濃度仍保持1%。
（2）總氮測定和非蛋白氮測定可用同一空白對照。
2 三氯醋酸沉淀法（新增）
本法系將供試品經三氯醋酸沉淀，通過測定該沉淀中的蛋白氮含量，計算出蛋白質的含量。
測定法 量取適宜體積的供試品（每1ml含蛋白質為4-10mg）于適宜的尖底離心管中，加等體積的12%三氯醋酸（12→100）混勻，靜置30分鐘后，離心（4000轉/分鐘），棄上清，用約3ml水分數次將沉淀洗入凱氏定氮瓶中，照氮測定法（附錄VI A）測定供試品中總氮含量，同時做空白對照。
按下式計算：
（VX-V0）×C×14.01×2
供試品蛋白質含量（mg/ml）= —————————————×6.25
V
式中VX 為供試品消耗酸滴定液的體積，ml;
V0為空白試驗消耗酸滴定液的體積，ml;
C為硫酸滴定液的濃度，mol/L;
V 為供試品的體積，ml。
第二法Lowry法
本法用于微量蛋白質的含量測定。蛋白質在堿性溶液中可形成銅-蛋白質復合物, 此復合物加入酚試劑后, 產生藍色化合物, 該藍色化合物在650nm處的吸光度與蛋白質含量成正比，根據供試品的吸光度，計算供試品的蛋白質含量。
試劑（1）酚試劑 取鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O）100g、鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）25g，置1500ml蒸餾瓶中，加入700ml水、85%磷酸50ml、鹽酸100ml，上連回流管（使用木塞或錫紙包裹的橡皮塞）微沸回流10小時。取下回流管，加入硫酸鋰150g、水50ml、溴液幾滴，煮沸約15分鐘，驅除過量的溴。冷卻，加水至1000ml，過濾，為酚試劑貯備液。
酚試劑貯備液 用氫氧化鈉滴定液（0.5mol/L）測定酸濃度，然后加水稀釋至相當于1mol/L鹽酸濃度。
（2）堿性銅溶液 取0.1mol/L酒石酸鉀溶液與0.04mol/L硫酸銅溶液各0.5 ml，4%碳酸鈉溶液與0.8%氫氧化鈉溶液各25 ml，搖勻，即得。本液應臨用配制。
（3）氫氧化鈉滴定液（0.5mol/L）的配制及標定 取氫氧化鈉適量，加水攪拌使溶解成飽和溶液，冷卻后，置聚乙烯塑料瓶中，靜止數日，澄清后，取澄清的氫氧化鈉飽和溶液28ml，加新煮沸后冷卻的水，使成1000ml，搖勻。
取在105℃干燥至恒重的基準鄰苯二甲酸氫鉀約3g，精密稱定，加新沸過的冷水50ml，振搖，使其盡量溶解；加*指示劑2滴，用本液滴定；在接近終點時，應使鄰苯二甲酸氫鉀*溶解，滴定至溶液顯粉紅色。每1ml氫氧化鈉滴定液相當于102.1mg的鄰苯二甲酸氫鉀。根據本液的消耗量與鄰苯二甲酸氫鉀的取用量，算出本液的濃度。
標準蛋白質溶液的制備 取*標準品一支，用水定量稀釋至每1ml含1mg，作為貯備液。精密量取貯備液2.5ml置25ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即為每1ml含100μg的標準蛋白質溶液。
測定法 精密量取一定體積供試品（含蛋白質50μg左右）置試管內，加水至1ml，加堿性銅溶液5ml,搖勻，室溫放置10分鐘, 快速加入酚試劑0.5 ml，搖勻，室溫放置30分鐘，顯色后，照紫外-見分光光度法（附錄Ⅱ A），在波長650nm處測定吸光度（呈色后，如發現渾濁，經每分鐘3000轉離心15分鐘后，取上清液測定）。精密量取標準蛋白質溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml分別置于試管中，自“加水至1ml”起，同法操作。準確量取水1ml，自“加堿性銅溶液5ml”起，同法操作，作空白對照。以標準曲線的蛋白質濃度對應其吸光度，求直線回歸方程；將測得供試品的吸光度代入直線回歸方程，即得供試品的蛋白質含量。
第三法 雙縮脲法
本法系依據蛋白質肽鍵在堿性溶液中與Cu2+形成紫紅色絡合物，其顏色深淺與蛋白質含量成正比，利用標準蛋白質溶液作對照，采用紫外-可見分光光度法測定供試品蛋白質含量。
試劑 雙縮脲試劑。取硫酸銅（CuSO4·5H2O）3.0g、酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4H2O）9.0g、*5.0g、氫氧化鈉24g，加水溶解并稀釋至1000ml，搖勻，即得。
標準蛋白質溶液的制備 精密量取*標準品適量，用水定量稀釋成每1ml 含50mg的溶液。
供試品溶液的制備 精密量取適量的供試品，加水制成每1ml約含50mg的溶液。
測定法 分別精密量取供試品溶液與標準蛋白質溶液各0.05ml置玻璃試管中，分別加雙縮脲試劑4.0ml，混勻，置37℃水浴中30分鐘，照紫外-可見分光光度法（附錄Ⅱ A），在波長540nm處測定吸光度。另精密量取水0.05ml，自“加雙縮脲試劑4.0ml”起，同法操作，作為空白對照。
按下式計算
蛋白質含量（mg/ml）= A1×c×n
——————
A2
式中A1為供試品溶液的吸光度；
A2為標準蛋白質溶液的吸光度；
c為標準蛋白質溶液的濃度，mg/ml；
n為供試品稀釋倍數。
【附注】本法的測定范圍為1～10mg。
在線客服